新观点抗体噬菌体展示与酵母展示的本质区别

啃蝌蚕丝

1什么是酵母展示平台
酵母展示是指外源蛋白质肽通过连接或锚定至酵母细胞壁组合物而在细胞表面表达。为了现这一点，外源基因与细胞壁蛋白基因融合，其中Aga2p比较常用于抗体展示。Aga2p属于负责融合事件的酵母凝集素蛋白家族，通过Aga1p上的两个二硫键固定在细胞表面。利用Aga2p作为融合蛋白的点之一是其距离细胞壁较远，因此融合的抗体在空间上更加灵活，避免了由于空间位阻而导致的活性损失。另一个点是，Aga2p在细胞生长后在GAL1启动子的控制下表达，保护酵母细胞免受潜在有抗体的侵害，从而确保文库中所有抗体的展示。然后用抗原包被的磁珠对展示有抗体或其他蛋白质的酵母进行筛选，然后进行几轮FACS筛选具有所需特性的抗体蛋白质。


图1：酵母文库展示示意图
2什么是噬菌体展示
噬菌体是一类由外壳蛋白包裹DNA或RNA的病。它们可以感染作为宿主的细菌，将其基因插入细菌基因组中，并产生外壳蛋白和基因以在细胞质中重组噬菌体颗粒，然后分泌到周质中。转化细菌后能够产生噬菌体的质粒称为噬菌粒。当外源基因插入噬菌粒并转化为细菌时，就会产生衣壳上展示有外源蛋白肽的噬菌体。

图2：噬菌体展示技术

3酵母展示和噬菌体展示有什么区别
酵母展示在某些方面比噬菌体展示有势，但也有一些缺点。
(1)在筛选淘选步骤中，酵母展示适用于FACS，可以精确筛选出具有所需结合特性的抗体。然而，噬菌体展示中抗体与抗原的亲和力只能通过调整洗涤缓冲液成分来粗略分层。
(2)由于其真核表达系统，酵母展示的抗体可以被正确折叠和修饰，例如糖基化，与大肠杆菌在噬菌体展示中表达的抗体相比，更接近其在哺乳动物中的天然结构。
(3)由于酵母的转化效率较低，酵母展示的抗体多样性可能低于噬菌体（酵母为107-109，噬菌体比较多为1011）。
(4)由于酵母表面上的抗体拷贝数(104-105)比噬菌体多得多，因此可以利用酵母展示系统根据抗体亲合力筛选出低亲和力抗体。

4泰克生物能够为客户提供高质量的噬菌体文库构建服务
M13单链丝状噬菌体展示系统是目前应用较广泛的文库展示系统，通过将蛋白、抗体或多肽与噬菌体pIII蛋白融合表达，使之参与噬菌体组装，并展示在噬菌体表面，形成噬菌体展示文库，泰克生物利用M13丝状噬菌体壳蛋白pIII和PII展示技术，能够为客户构建不同物种的天然或者免疫的噬菌体抗体展示文库，通过抗体库技术制备多物种单克隆抗体，如人，鼠，兔，鸡，羊，鹅，猪，牛，马，驴，骆驼，羊驼，鲨鱼等物种来源的单克隆抗体，可根据客户的需求提供定制服务，并且库容量可达1011。

5泰克生物为客户提供噬菌体文库构建服务的全流程介绍
泰克生物为客户提供噬菌体文库构建服务，流程包括：总RNA提取，反转录获取cDNA，PCR扩增，载体与PCR产物酶切连接，细菌文库构建，噬菌体文库构建，噬菌体文库效价检测。

图3：噬菌体展示抗体库构建流程
51总RNA提取
将外周血淋巴细胞从冰箱取出后分装，加入氯仿，离心后取上清加入异丙醇，离心保留沉淀，加入75%乙醇后离心保留沉淀，干燥后加入DEPC水，孵育确保RNA溶解，将各管混合到一管中即为总RNA，取1μl总RNA进行电泳，取2μl用核酸浓度测量仪测浓度。

图4：VHHRNA提取
52反转录获取cDNA
按照商业化试剂盒操作说明书进行cDNA制备，将上一步得到的RNA一分为二反转录成cDNA，反转录引物分别用OligodTprimer及random6-mers。

53PCR扩增
531首轮PCR
以cDNA为模板进行首轮PCR反应，使用HSExTaq酶进行PCR扩增。PCR反应体系为：

试剂
使用量
cDNA
05-5μl
AlpVh-LCALL002
2μl2μl
dNTPMix
4μl
10×ExTaqBuffer
5μl
HSExTaq
025μl
ddH2O
Upto50μl

将得到的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，找到目的条带进行上述条件PCR扩增，将所有PCR产区进行1%琼脂糖凝胶电泳，使用通用型DNA纯化回收试剂盒对切胶的胶条进行DNA回收。

图5：首轮PCR扩增结果

532第二轮PCR
以上一步PCR扩增并回收后的DNA片段作为模板再次扩增特定的抗体片段，PCR反应体系为：

试剂
使用量
首轮PCR回收产物
01-2μl
RvhhFPRvhhRP
2μl2μl
dNTPMix
4μl
10×ExTaqBuffer
5μl
HSExTaq
025μl
ddH2O
Upto50μl

将得到的PCR扩增产物使用DNA纯化回收试剂盒按说明书回收。

图6：第二轮PCR扩增结果
54载体与PCR产物酶切连接
第二轮PCR产物通过酶切连接到噬菌体质粒pADL-10b中，从而构建含有扩增片段的噬菌体质粒库。将连接产物使用DNA纯化回收试剂盒按说明书回收，分别取2μl用核酸浓度测量仪检测回收产物的浓度。
55细菌文库构建
将连接产物进行电击转化后构建含有目的抗体片段的大肠杆菌文库。
取SS320大肠杆菌感受态细胞，加入回收后的连接产物，将混合后的感受态细胞和连接产物转移到预冷好的电转杯中，使用电转仪预设的转化程序电击转化，电转后立即往电转杯中加入950μlSOC培养基，至少进行20个电转。将细胞复苏后涂在含有氨苄抗性的琼脂糖培养板上过夜生长。将上一步过夜生长后的培养板上的细胞用2xYT培养基和涂布棒冲洗刮下，加入20%的甘油测OD600nm值后保存在-80℃，即为细菌文库。


图7：VHH阳性率：>90%
56噬菌体文库构建
561噬菌体文库扩增
将上一步刮下的菌体混匀后转移到100mL预先加入四环素的2xYT培养液中，37℃，250rpm培养直至OD600nm达到05-055。
按照辅助噬菌体：细菌细胞数目为20:1的比例加入辅助噬菌体后继续37℃培养30分钟。加入终浓度为50μgmL的Kana和终浓度为02mMIPTG，30℃过夜摇床培养。
562噬菌体文库制备
将过夜培养的细菌4℃4000rpm离心20分钟，将上清转移到新的离心管后加入14体积预冷的的20％PEG25MNaCl，在冰上孵育30分钟。4℃4000rpm离心20分钟去除上清后加入1mLPBS缓冲液溶解沉淀。再次加入14体积预冷的20％PEG25MNaCl后冰上孵育10分钟，4℃12000xg离心10分钟后去除上清并将沉淀溶解在1mLPBS中得到噬菌体库，长期-80℃保存，短期（1-2周）可于4℃放置保存。
57噬菌体文库效价检测
将-80℃冰箱保存的SS320菌株培养后，从单菌落板上挑取一个单菌落到5ml2×YT培养基过夜培养，过夜培养菌液OD600为05-055。取制备好的噬菌体文库稀释12个梯度，每个梯度加入90μl的SS320菌液培养，每个稀释管取5μl加到2×YT固体培养基（Amp）过夜培养，即可计算效价。



业内人士认为，抗体开发的发展标志着整个行业在快速稳步的前进中。泰克生物为客户提供基于M13噬菌体抗体展示系统的高亲和力、高特异性的抗体药物前期发现技术服务，为客户后续的CAR-T/CAR-NK先导序列设计、抗体人源化、药物靶点抗体开发、双特异性抗体开发以及高效阻断型中和抗体开发等下游研发工作提供有力支持。https://www.tekbiotech.com/