新观点育种专栏 3-分子标记发展及其特点

啃蝌蚕丝

分子标记是分子育种的基础

今天就和小编一起来了解下各种分子标记类型与特点

首先，什么是分子标记?

通俗理解下，我们在日常生活中，去某个地方通常需要寻找某个标志性建筑来获得定位。同样地，寻找和定位分布在基因组染色体上的基因或位点也需要通过标记来导航，那么分子标记就是通过核苷酸等分子来进行标识的。多态性是标记比较重要的特征，顾思义，多态即多种状态，也就是差异性。一个基因/位点在不同材料中处于不同状态，具有差异，才能进行区分和比较。也就是分子标记的意义所在。

在分子标记利用之前，遗传标记经历了从形态标记(如高矮胖瘦)，到细胞学标记(如染色体数目与形态)，再到生物化学标记(如血清蛋白、同工酶等)的发展。但这些标记都法直接反映遗传物质的特征，仅是遗传物质的间接反映，且易受环境的影响，因此具有很大的局限性。

分子标记直接反映了DNA水平上的遗传变异，能稳定遗传，信息量大，可靠性高，消除了环境的影响。现在分子标记技术有数十种，已广泛应用于作物遗传育种中，如基因组遗传图谱构建、基因定位与克隆、植物亲缘关系鉴别、种质基因库构建等方面。

理想的分子标记通常具有如下特点：

高水平多态性;

共显性遗传(可区分某一位点的纯合或杂合状态);

在基因组中出现频率高;

在基因组中均匀分布;

具有中性选择特征;

容易获得且可速分析;

重复性好;

分离标记所需费用低。

目前通常认为分子标记经历了代技术的发展，代表性分子标记包括RFLP、AFLP、SSR、SNP、InDel等。

首代分子标记

首代分子标记基于分子杂交设计。比较典型的分子标记代表类型如限制性片段长度多态性(RFLP)，是以Southern杂交为核心设计。

其基本原理是：利用特定的限制性内切酶识别并切割(消化)不同生物个体的基因组DNA，由于不同个体等位基因之间的碱基互换、重排、缺失等变化导致限制性内切酶识别位点发生改变，从而造成基因型间限制性片段长度的差异。将这些片段电泳、转膜、变性，与标记过的探针进行杂交，洗膜，即可分析其多态性结果。



RFLP在早期广泛应用于基因定位、探究染色体结构和功能。标记特点大多数为共显性，且标记的重复性和稳定性好。但技术不够成熟，多态性低，DNA质量要求高，技术繁杂，使用受限。RFLP 作为首种低成本的 DNA 分型技术，现在基本上已经过时。

第二代分子标记

第二代分子标记基于PCR开发设计。根据引物特点(随机或特异)以及是否与限制性酶相结合，可分为多种不同类型标记。

分类如下所示：

基于PCR        基于PCR和限制性酶切结合
以随机引物PCR为核心：随机DNA扩增多态性（RAPD）、简单序列重复间区（ISSR）、随机扩增微卫星多态性(RAMPs)。

基于对限制性酶切片段的选择性扩增来显示片段长度的多态性：扩增片段长度多态性（AFLP）、cDNA-AFLP。

以特异引物PCR为核心：简单序列重复（SSR）、相关序列扩增多态性(SRAP)、靶位区域扩增多态性(TRAP)。        基于对PCR扩增片段的限制性酶切来显示扩增区域的多态性：酶切扩增多态性序列（CAPS）、dCAPS。
相比于首代，第二代分子标记技术更为先进，多态性更高，所需DNA量少，但花费高。早期广泛应用于辅助育种、遗传图谱构建、系统进化和遗传多样性等分析。



也有学者仅将SSR作为第二代分子标记代表，将其他如RAPD、AFLP等标记视为首代分子标记，这关要紧。根据以上标记称，我们可以大体判断出每种标记所用的技术，因此这里不一一介绍。在应用的时间节点上，SSR独树一帜，小编读研时跑的多是SSR标记。相信不少老师的验室还在用这种标记吧，所以这里多聊一下。

SSR又称微卫星标记，是一类由几个(1~6个)碱基为重复单位串联而成的DNA序列，长度一般在100bp以内。常见的形式有 (TG)n、 (GA)n、(AAT)n或 (GACA)n等，植物基因组中以(AT)n比较常见，这种基序广泛存在于真核生物和部分原核生物基因组中，随机分布在核DNA、叶绿体DNA和线粒体DNA中。

SSR的原理是微卫星DNA两侧多是高度保守的单拷贝序列，所以可根据两侧序列设计引物用于PCR扩增，再利用凝胶电泳检测PCR产物大小。SSR高度多态性主要来源于核心序列串联重复数目不同。



SSR标记的特点：

点        缺点
共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子；DNA样品量少，对DNA质量要求不高；重复性好，可靠性高；具有大量的等位差异，多态性十分丰富。

必须知道重复基序两端的DNA序列信息。如不能直接从DNA数据库查询，则首先必须对其进行测序，再设计引物，开发成本高。

    第代分子标记

第代分子标记是基于核酸序列开发。随着DNA测序技术的发展，以单核苷酸多态性(SNP)为代表的第代分子标记迅速发展成为主流，SNP是由于基因组的某个位点上单个核苷酸的变异而产生的差异。

SNP标记的特点：

点        缺点
数量多，分布广泛均匀；稳定性高；共显性；适于速、规模化筛查。

如果用测序或DNA芯片杂交的方法，成本较高。

SNP标记虽然大量涌现，但对持续大样本的SNP分型是仍是个难题。经典的利用SNP分型的方式包括设计限制性内切酶标记(CAPS、dCAPS)以及Sanger一代测序等，缺陷都是周期长，费用高。针对这一问题，近几年来研究人员发展了众多SNP分型技术，如竞争性等位基因特异性PCR(KASP)、靶向测序基因分型(GBTS)、Hyper-seq等。尽管如此，对于科研端普通验室而言，购置配套的仪器设备相当困难;对于应用端种企而言，成本仍然是个大问题。

目前至少有20种SNP基因分型方法，包括以凝胶为基础的传统方法和以高通量自动化为基础的新方法。

这里小编列出部分：

酶切扩增多态性序列法：CAPS、PCR-RFLP
等位基因特异性PCR技术：AS-PCR
单链构象多态性法：SSCP
变性高效液相色谱法：DHPLC
高分辨率溶解曲线：HRM
质谱检测法：MAL-DI-TOF-MS
基因芯片技术：Illumina、Affymetrix
竞争性等位基因特异性PCR：KASP
简化基因组测序：GBS、RADseq、Hyper-seq
靶向测序：GBTS、MNP
全基因组重测序：WGS、LcWGS
几种常见SNP检测方法的比较如下表所示：



高通量、高准确性和低成本的基因分型仍然是SNP广泛生产应用的关键限制因素。后续我们将重点介绍几种目前主流的相对较低成本的基因分型策略。

下表总结比较了第1-3代标记中几种代表性的DNA分子标记的特点

标记类型        遗传特点        引物类型        多态性        重现性、可靠性
RFLP        共显性        DNA特异       
中

高
RAPD        多数显性        9-10bp特异        较高        低
SSP        共显性        14-16bp特异        高        高
AFLP        显性/共显性        16-20bp特异        较高        高
SNP        共显性        特异        高        高
其他标记分类

当然除了DNA外，还有其他的分子标记类型，如蛋白、代谢物小分子等标志物。除按不同类型分子或组学分类外，还可按位置、功能等进行分类。

以mRNA为基础：表达序列标签(EST)

按位置分：物理标记

按功能分：功能标记

非核标记：如mtDNA

这里不是我们关注的重点，不做赘述。

好了，分子标记发展与特点就了解到这里。下期我们选择几种当前主流的、常见的基因分型技术进行介绍。拜~~~

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